遺伝子組換え微生物を利用して製造された添加物の安全性評価基準 Standards for Safety Assessments of Food Additives produced Using Genetically Modified Microorganisms 平成十六年食品安全委員会決定 Food Safety Commission Decision of 2004 遺伝子組換え微生物を利用して製造された添加物の安全性評価基準 Standards for Safety Assessments of Food Additives produced Using Genetically Modified Microorganisms （平成十六年三月二十五日食品安全委員会決定） (Food Safety Commission Decision of March 25, 2004) 第１章総則 Chapter I General Provisions 第１　評価基準作成に至る背景 No. 1 Background on the establishment of standards for assessment 厚生省（当時）の「組換えＤＮＡ技術応用食品・食品添加物の安全性評価指針（平成３年策定）」に基づき、平成６年に初めて遺伝子組換え技術を利用して製造された食品添加物の安全性の確認がなされ、平成８年には、種子植物に由来する遺伝子組換え食品の安全性の確認がなされた。以来、多くの遺伝子組換え食品及び添加物の安全性確認が行われてきた。さらに、食品衛生法の規定に基づく食品、添加物の規格基準の改正により、平成１３年４月より、遺伝子組換え食品等の安全性審査が法的に義務付けられることとなった。平成１５年７月、食品安全委員会の新設とともに、遺伝子組換え食品及び添加物の安全性評価が、厚生労働省の意見の求めに応じて、食品安全委員会においてなされることとなった。 Based on the Guideline for Safety Assessments of Foods and Food Additives Produced by Recombinant DNA technologies established in 1991 by the Ministry of Health and Welfare (at that time), the first safety assessment of food additives produced by recombinant DNA technology was conducted in 1994, and in 1996, safety assessment of genetically modified foods derived from seed plants was conducted. Since then, confirmation of the safety of a number of genetically modified foods and food additives has been carried out. Moreover, following a revision of the standards for food and food additives under the provisions of Food Sanitation Act, since April 2001 safety assessments of genetically modified foods have been mandatory. In July 2003, Food Safety Commission was newly established, and subsequently, safety assessments of genetically modified foods and food additives, have been conducted by Food Safety Commission at the request of Ministry of Health, Labour and Welfare. 本基準は、食品安全委員会における遺伝子組換え微生物を利用して製造された添加物（以下、「遺伝子組換え添加物」という。）の安全性を評価するために必要とされる原則及び事項を、厚生労働省の安全性審査基準等を基に検討し、安全性評価基準として定めたものである。 In these Standards, the principles and matters necessary for the assessment of the safety of additives produced using genetically modified microorganisms (hereinafter referred to as "Genetically Modified Additives") to be conducted by the Food Safety Commission, which are considered on the basis of the Ministry of Health, Labour, and Welfare's safety investigation standards, are prescribed as Safety Assessment Standards. 第２　定義 No. 2 Definitions 酵素等を用いた切断及び再結合の操作によって、ＤＮＡをつなぎ合わせた組換えＤＮＡ分子を作製し、それを生細胞に移入し、かつ、増殖させる技術（自然界における生理学上の生殖又は組換えの障壁を克服する技術であって伝統的な育種及び選抜において用いられない技術に限る。） Technology in which recombinant DNA molecules with assembled DNA prepared by cleavage and the recombination of DNA using enzymes or other methods are transferred to living cells for proliferation. (The term refers to technologies that overcome natural physiological reproductive or recombinant barriers, and that are not technologies used in traditional breeding and selection.) ２　宿主 2 Host 組換えＤＮＡ技術において、ＤＮＡが移入される生細胞及び個体 A living cell and/or an individual organism into which DNA may be transferred using recombinant DNA technology ３　ベクター 3 Vectors 目的とする遺伝子又はＤＮＡを宿主に移入し、増殖させ、又は発現させるため当該遺伝子を運搬するＤＮＡ A carrier DNA that transfers the gene of interest or DNA into a host and proliferates and expresses its gene. ４　挿入遺伝子 4 Inserted gene ベクターに挿入される遺伝子 A gene inserted into a vector ベクターに挿入されるＤＮＡ DNA inserted into a vector ６　供与体 6 Donors 挿入ＤＮＡを提供する微生物又は動植物等 A microorganism, animal, or plant that supplies inserted DNA ７　発現ベクター 7 Expression vector 新たな性質を賦与させるために構築された挿入遺伝子又はＤＮＡを含むベクター A vector with inserted genes or DNA constructed in order to confer new properties ８　組換え体 8 Recombinant 組換えＤＮＡを含む宿主 A host containing recombinant DNA ９　遺伝子産物 9 Gene product 挿入遺伝子の塩基配列から予想されるＲＮＡ又はタンパク質 RNA or protein deduced from the nucleotide sequence of an inserted gene １０　遺伝子組換え微生物 10 Genetically modified microorganisms 組換えＤＮＡ技術を応用して得られた微生物（細菌、酵母、糸状菌） Microorganisms (bacteria, yeast, fungi) obtained by applying recombinant DNA technology 第３　対象となる添加物及び目的 No. 3 Target additives and the purpose of these Standards 本基準は、遺伝子組換え添加物の安全性評価を行うに当たって必要とされる評価の基準を定めることを目的とする。 The purpose of these Standards is to provide assessment criteria required for assessment of the safety of genetically modified additives. 本基準において対象とする遺伝子組換え添加物は、食品衛生法で認められている添加物の範囲内であるものとし、原則として、「組換えＤＮＡ技術によって最終的に宿主に導入されたＤＮＡが、当該微生物と分類学上の同一の種に属する微生物のＤＮＡのみである場合」、又は「組換え体と同等の遺伝子構成を持つ生細胞が自然界に存在する場合」に該当する微生物を利用して製造されたものは含めないものとする。但し、当該添加物のヒトの健康に及ぼす影響の内容及び程度が明らかでないと判断された場合には、必要に応じて、その影響を検討することとする。また、製造に用いられた遺伝子組換え微生物（組換え体）が残存する場合は、別途定める遺伝子組み換え食品（微生物）に係る安全性評価の基準を同時に満たす必要がある。 Genetically modified additives targeted in these Standards are to be within the range of additives which are approved under the Food Sanitation Law. In principle, additives produced using microorganisms that fall under "cases where DNA ultimately introduced to the host through recombinant DNA technology is only DNA from a microorganism belonging to the same taxonomic species as said microorganism" or "cases where living cells that have an equivalent genetic structure to that of the recombinant exist in the natural world" are not included. However, if it is determined that the content and degree of the effects on human health of said additive is not clear, the effects are to be examined as required. Also, if the genetically modified microorganisms (recombinants) used in production remain, there is a need to simultaneously meet the standards of the safety assessment concerning said genetically modified foods (microorganisms) prescribed respectively. なお、遺伝子組換え添加物の研究開発・製造及び上市における環境、倫理、道徳、社会経済に係る事項の審査を目的とするものではない。 The objective of these Standards is not the examination of matters concerning the environmental, ethical, moral, and socioeconomic aspects of research and development, production and marketing of genetically modified additives. 第４　遺伝子組換え添加物の安全性評価の原則と基本的な考え方 No. 4 Principles and fundamental approach for safety assessment of genetically modified additives 遺伝子組換え添加物に関しては、一般に、組換え体そのままを食する遺伝子組換え食品とは異なり、最終産物としての添加物製品の安全性評価を行うことが適切である。この点で、遺伝子組換え添加物に組換えＤＮＡ技術の応用に起因する新たな有害成分が存在していないことが重要である。 In respect of genetically modified additives, generally speaking it is appropriate to conduct safety assessments of additive products as end products, different in comparison to those of genetically modified foods in which the recombinant is eaten as is. For this reason, it is important that genetically modified additives contain no new harmful substances that come about due to the application of recombinant DNA technology. 従って、遺伝子組換え微生物（組換え体）を利用して、微生物起源の添加物を製造するような場合には、従来の添加物に新たに加えられる組換え体由来成分を中心に安全性評価を行うことが合理的である。 Accordingly, if additives of microbial origin are produced using genetically modified microorganisms (recombinants), it is reasonable to conduct safety assessments focusing on the recombinant-derived components that are newly added to conventional additives. しかし、遺伝子組換え微生物を利用して、動物性の酵素を製造するような例においては、従来の添加物と遺伝子組換え添加物の有効成分の比較に加えて、組換え体と安全な使用経験のある宿主のそれぞれに由来する夾雑物等の非有効成分の比較を行い、組換え体由来成分に係る安全性評価を行うことが必要である。 However, in cases where animal enzymes are produced using genetically modified microorganisms, it is necessary that safety assessments are conducted concerning the recombinant-derived components, comparing non-active ingredients of foreign substances derived from each of both the recombinant and the host with history of safe use, in addition to the active ingredients from each of conventional additives and genetically modified additives. いずれにおいても、当該添加物の製造に用いられた組換え体（遺伝子組換え微生物）について、既存の宿主との比較における安全性評価を行う必要がある。その評価においては、意図的に生産された有効成分の質的及び量的な変化に加えて、非意図的に混入するおそれのある夾雑物等の非有効成分の質的及び量的な変化についても、考慮する必要がある。 In any case, it is necessary that safety assessment of the recombinant (genetically modified microorganism) used in production of said additive is conducted by comparing the recombinant used in the production of said additives and the existing host. In this assessment, it is necessary that not only both qualitative and quantitative changes in active ingredients that are produced intentionally, but also both qualitative and quantitative changes in non-active ingredients of foreign substances that may be mixed unintentionally, are taken into account. 一方、添加物は、その性質、用途、製法等の点において、極めて多岐に亘っているものである。また、高分子の添加物、特に食品用酵素に関しては、食品の製造過程で変性・失活する場合が多く、食品から最終的に除去されることも多い。このため、遺伝子組換え添加物に関しては、必要に応じて、当該添加物の精製の程度、その使用形態及び食品中での残存等も考慮し、ケースバイケースで安全性評価を行う必要がある。 At the same time, there are an extremely wide variety of additives in terms of properties, intended uses, manufacturing methods, and other points. Moreover, macromolecular additives, especially food enzymes are often denatured and deactivated during the manufacturing process of food and are eventually removed from the food. For this reason, the safety assessments of genetically modified additives shall be conducted on a case-by-case basis, taking into account the degree of refinement of said additives, patterns of usage, residue in food, and other matters as necessary. 以上のような原則に立って、以下の基本的な考え方に従って、安全性の評価を行う。 In accordance with the principles described above, safety assessments shall be conducted based on the following basic approach: １　遺伝子組換え添加物の安全性評価が可能とされる範囲は、原則として、添加物製造への利用経験又は食品としての食経験のある非病原性の宿主に由来する組換え体の利用に限り、食品衛生法で認められている添加物との比較が可能である場合とする。 1 In principle, safety assessments of genetically modified additives are deemed to be feasible only in cases where recombinants derived from nonpathogenic hosts with a history of use in the production of additives or a history of use as foods are used, and also when comparison with additives approved by Food Sanitation Act is possible. ２　遺伝子組換え添加物の安全性に関しては、組換えＤＮＡ技術によって宿主に賦与されることが予想される全ての形質の変化について、これらがヒトの健康に対し予期せぬ有害影響を与える可能性がないことを明らかにするための評価を行う。 2 The assessment of the safety of genetically modified additives is conducted in order to clarify the impossibility that any of the changes in the characteristics expected to be conferred to the host through recombinant DNA technology will have an unexpected harmful effect on human health. このような組換え体の安全性評価において考慮すべき形質としては、栄養阻害物質、内因性毒素、アレルギー誘発性物質、生理学的活性物質、遺伝子導入に起因する組換え体における代謝経路の変化に基づく二次的影響等が挙げられる。 The characteristics that should be considered when conducting such safety assessment of recombinants include antinutrient content, endogenous toxins, allergenic substances, physiologically active substances, and secondary effects arising from changes in metabolic pathways in the recombinants attributable to the gene introduction. ３　原則で述べたように、遺伝子組換え添加物においては、組換え体をそのまま食する訳ではなく、その製造方法、利用の方法及び形態が、それ自体を食する遺伝子組換え食品の場合とは異なっていることから、安全性評価において重点を置くべき点も異なってくる。すなわち、必要に応じて、遺伝子組換え添加物の精製の程度、その使用形態及び非意図的に混入するおそれのある夾雑物等の非有効成分も含めた食品中での残存等も考慮し、製品毎にケースバイケースで安全性評価を行うことが合理的である。 3 As described above in the principles, with regard to genetically modified additives, the recombinant is not eaten as is, its method of manufacture and methods and patterns of usage are different from that of genetically modified foods, which themselves are eaten, therefore, the points to be emphasized in safety assessment are different. That is to say, it is reasonable to conduct safety assessments for each product on a case-by-case basis, taking into consideration the degree of refinement of genetically modified additives, their patterns of usage, persistence in food including foreign substances and other non-active ingredients that are likely to be unintentionally mixed in, and other matters as required. 例えば、組換え体が添加物の製造に使用されるものの、遺伝子産物そのものが添加物の有効成分でなく、代謝産物が有効成分である場合（リボフラビン等）には、組換え体に由来する有効成分以外の新たな成分が添加物に残存しないか、又はその成分の安全性に問題がないことを明らかにすることが重要である。 For example, in cases where metabolic products such as riboflavin are the active ingredient of an additive and the gene products themselves are not active ingredients, even though recombinants are used in the production of the additive, it is important to clarify that new components derived from the recombinant besides the active ingredient do not remain in the additive or do not pose any safety risk. また、有効成分以外の新たなタンパク質が組換え体で産生され、最終的に、遺伝子組換え添加物より除去されない場合には、当該タンパク質の毒性やアレルギー誘発性等の有害作用についても安全性評価を行う必要がある。 Also, in cases where new proteins besides the active ingredient are produced by the recombinant and are not ultimately removed from the genetically modified additives, safety assessments must be conducted on said protein for adverse effects such as toxicity and allergenicity. また、遺伝子組換え添加物が食品用酵素に該当する場合で、当該遺伝子組換え添加物が、アミノ酸置換を伴うような場合には、必要に応じて、毒性やアレルギー誘発性等の有害作用についても評価する必要がある。 Furthermore, in cases where a genetically modified additive is classifiable as a food enzyme, assessments must be conducted for adverse effects such as toxicity and allergenicity as needed when said genetically modified additive involves amino acid substitutions. ４　安全性評価のために行う試験は、科学的に信頼できる概念と原則に従うと共に、必要に応じＧＬＰに従って計画・実施されるべきである。また、原データは要求に応じて提出されるべきである。安全性評価に必要とされるデータ又は情報としては、開発者等が作成する実験データの他に、既に公開された科学論文や、第三者からの情報等があるが、それらのデータは科学的に信頼できる方法を用いて入手し、適切な統計学的技術を用いて解析されている必要がある。また、分析方法には可能な限り定量下限値が示されるべきである。 4 Tests conducted for safety assessments should follow scientifically reliable concepts and principles and, when needed, should be planned and implemented following GLP. Source data should be submitted as required. Data and information that are required for safety assessments include experimental data prepared by developers and researchers, previously published scientific articles, and information from third parties. It is important that these data are obtained using scientifically reliable methods and analyzed using appropriate statistical techniques. Also, the lower limit of quantitation of the analytical methods should be shown wherever possible. ５　現在、抗生物質耐性マーカーとして使われているカナマイシン耐性遺伝子等は、適切に安全性の評価がなされたものであり、直ちに安全性上問題となるものではない。なお、今後の遺伝子組換え添加物の製造に利用される遺伝子組換え微生物の開発においては、安全性が充分に評価され、かつ抗生物質耐性マーカー遺伝子を用いない形質転換技術を容易に利用できる場合には、その技術を用いることも考慮されるべきである。 5 At present, kanamycin resistance genes used as antibiotic resistance markers have been appropriately assessed for safety and present no immediate safety concerns. For the future development of genetically modified microorganisms used in the production of genetically modified additives, if transformation techniques on which thorough safety assessments are conducted and that do not use antibiotic resistance marker genes become readily available, the use of those techniques should be considered. ６　組換えＤＮＡ技術については、日々進歩しているものであり、本安全性評価基準に関しても、技術の進歩に伴って、必要に応じた見直しを行っていく必要がある。 6 Since recombinant DNA technology is advancing on a daily basis, these standards for safety assessment will need to be reconsidered as required needed in accordance with the advancement of said technology. 第２章　遺伝子組換え添加物の安全性評価基準 Chapter II Standards for safety assessments of genetically modified additives 第１　安全性評価において比較対象として用いる添加物及び宿主等の性質並びに遺伝子組換え添加物及び組換え体との相違 No.1 Properties of the additives and hosts to be compared in safety assessments, and the differences between the additives and genetically modified additives, as well as those between the hosts and recombinants 次の１から６までの事項の概略を記し、遺伝子組換え添加物の安全性評価を行う上で必要とされる比較対象として食品衛生法で認められている添加物が存在すること、また、その製造に用いられる組換え体の由来する宿主の性質が明らかであること、並びに、遺伝子組換え添加物と従来の添加物及び組換え体と宿主等の相違点が明確であることを示すことが必要である。 It is necessary to describe the outline of the matters stated in the following (1 to 6) and thereby to show that an additive approved by the Food Sanitation Law exists as a comparable additive as required in the safety assessment of genetically modified additives, that properties of the host from which the recombinant used for production of said additive is derived are clarified, and that the differences such as differences between genetically modified additives and conventional additives and differences between recombinants and hosts are clear. １　従来の添加物の性質及び用途等に関する資料 1 Information concerning conventional additives including properties and intended uses （１）名称、基原及び有効成分 (1) Name, origin, and active ingredient （３）用途及び使用形態 (3) Intended uses and patterns of usage （１）宿主の種名（学名）、株名等及び由来 (1) Species name (scientific name), strain name and origin of the host （２）ＤＮＡ供与体の種名、株名又は系統名等及び由来 (2) Species name, strain name or systemic name, and origin of the DNA donor ３　宿主の添加物製造への利用経験又は食経験に関する資料 3 Information on the host concerning the history of use in production of additives and the history of use as food ４　宿主の構成成分等に関する資料 4 Information on the host concerning its structural components 宿主に含まれる有害生理活性物質・栄養阻害物質（栄養素の消化・吸収等を阻害する物質）等がある場合は、その種類及び量の概要 If any harmful physiologically active substance or antinutrient (a substance that inhibits the digestion and absorption of nutrients) is included in the host, an overview of the type and amount of such substances ５　遺伝子組換え添加物の性質及び用途等に関する資料 5 Information on genetically modified additives concerning their properties and intended uses （１）製品名　及び有効成分 (1) Product name and active ingredient （３）用途及び使用形態 (3) Intended uses and patterns of usage （４）有効成分の性質及び従来の添加物との比較 (4) Properties of active ingredients and comparison to conventional additives ６　安全性評価において検討が必要とされる遺伝子組換え添加物と従来の添加物及び組換え体と宿主等の相違点 6 Differences between the genetically modified additives and conventional additives, and those between the recombinant and host or others that need to be considered in safety assessments 当該遺伝子組換え添加物及び組換え体と比較対象となり得る従来の添加物及び宿主等があると判断されれば、それらとの比較において、第２以下の各事項に掲げられた項目に沿って審査を行う。 If it is determined that there is a conventional additive and host that can be used in a comparison with said genetically modified additives and recombinant, the assessment shall be conducted based on the items listed in each matter under No. 2, making said comparisons. 第２　宿主に関する事項 No. 2 Matters related to hosts １　分類学上の位置付け（種名（学名）・株名等）等に関する事項 1 Matters related to the taxonomic position (species name (scientific name), strain name, etc.) and others 学名、株名等が明らかであり、その宿主（微生物）が添加物製造に安全に利用されてきた経験、食用に利用されてきた歴史（食文化）又は産業上の使用経験等が明らかであること。 The scientific name, strain name, etc. of the host should be specified, and also, a history of safe use in additive production, a history of safe use in food (diet culture), or experience of industrial use should be provided. ２　病原性及び有害生理活性物質等の生産に関する事項 2 Matters related to pathogenicity and production of harmful physiologically active substances 宿主は非病原性であること。また、有害生理活性物質を産生する場合、その種類、作用及び量が明らかであること。必要に応じて、宿主のアレルギー誘発性に関する知見が明らかであること。 The host should be nonpathogenic. In addition, if the host produces harmful physiologically active substances, the type, effect and amount of such substance should be provided. Information on allergenicity of the host should be provided as required. ３　寄生性及び定着性に関する事項 3 Matters related to parasitic and fixing properties 宿主が、ヒトや他の生物に寄生又は定着するか否かが明らかであり、寄生・定着する場合、ヒトや他の生物に悪い影響を与えるか否かが明らかであること。 Whether or not the host parasitizes or fixes itself in humans or any other organism should be clarified. If the host parasitizes or fixes itself in humans or any other organism, whether or not the host has a harmful effect on humans or any other organism should be clarified. ４　病原性の外来因子（ウイルス等）に汚染されていないことに関する事項 4 Matters related to not being contaminated by foreign pathogenic factors (such as viruses) 当該組換え体の開発に用いた宿主が病原性の外来因子（ウイルス等）に汚染されていないこと。 The host used in the development of said recombinant not being contaminated by foreign pathogenic factors (such as viruses). ５　宿主の近縁株の病原性及び有害生理活性物質の生産に関する事項 5 Matters related to pathogenicity and production of harmful physiologically active substances of the host's closely related strain 宿主の近縁株において、病原性がある場合や有害生理活性物質を産生するものがある場合、遺伝子組換え添加物の製造に用いた当該微生物においては、同様の病原性や有害生理活性物質の産生等の有無について明らかであること。 If there is any pathogenic strain or any strain that may produce harmful physiologically active substances in the strains closely related to the host, whether such pathogenicity or production of such substances exist in said microorganism used for the production of genetically modified additives should be clarified. なお、有害生理活性物質等の産生が認められる場合には、当該微生物を用いた製造に安全性上の問題がないと判断できる合理的な理由があること。 In addition, if the production of harmful physiologically active substances is observed, the rationale for determining that there are no safety concerns in production using said microorganisms should be provided. 第３　ベクターに関する事項 No. 3 Matters related to vectors １　名称及び由来に関する事項 1 Matters related to names and origins 遺伝子導入のために利用されたプラスミド等のベクターの名称及び由来が明らかであること。また、ヒトに対する有害性が知られていないこと。 The name and origin of the plasmid or other vectors used for gene transfers should be specified. In addition, the vector should not be known to be harmful to humans. ２　性質に関する事項 2 Matters related to properties （１）ＤＮＡの塩基数及びその塩基配列を示す事項 (1) Matters on the number of DNA bases and its sequence ＤＮＡの塩基数、塩基配列が明らかであること。さらにその塩基配列が公開されている場合には、公開データベースにおける登録番号が明らかであること。 The number of DNA bases and its sequence should be identified. In addition, if the sequence of bases is disclosed to the public, the public database identification number should be specified. （２）制限酵素による切断地図に関する事項 (2) Matters related to a restriction map with a restriction enzyme ベクターの切断地図が明らかにされていること。この場合、用いた制限酵素の名称の他、断片の数、サイズなどが明らかにされていること。 The restriction map of the vector should be identified. In such a case, the name of restriction enzymes used, as well as the number and size of fragments should be specified. （３）既知の有害塩基配列を含まないことに関する事項 (3) Matters related to not containing any base sequences which are known to be harmful. 既知の有害なタンパク質を産生する塩基配列が含まれていないこと。 The vector should contain no base sequences which are known to be harmful. （４）薬剤耐性に関する事項 (4) Matters related to drug resistance ベクター中に、薬剤耐性遺伝子が含まれている場合は、その遺伝子の性質が明らかであること。 If a drug resistance gene is contained in the vector, the properties of the gene should be clarified. （５）伝達性に関する事項 (5) Matters related to the transmissibility 原則として、伝達性（ベクターが宿主となる微生物から他の菌株へ自ら移動（水平伝播）できる性質）がないこと。伝達性がある場合は、伝達域が明らかであること。 In principle, the vector should show no transmissibility (i.e. the potential of the vector to autonomously migrate from the host microorganism to other strains [i.e. horizontal transmission]). If the vector is transmissible, the range of target organisms should be clarified. （６）宿主依存性に関する事項 (6) Matters related to host dependency 組換えに用いられたベクターが、他の微生物又はヒトでは増えないこと。他の微生物で増える場合は、宿主域が明らかであること。 The vector used in recombination should not proliferate in any other microorganism or in humans. If the vector does proliferate in other microorganisms, information on the range of target organisms should be provided. 第４　挿入ＤＮＡ、遺伝子産物、並びに発現ベクターの構築に関する事項 No. 4 Matters related to inserted DNA, gene products, and expression vector construction １　挿入ＤＮＡの供与体に関する事項 1 Matters related to the donor of the inserted DNA （１）名称、由来及び分類に関する事項 (1) Matters related to name, origin and classification 名称、由来及び分類が明らかであること。 Name, origin and classification should be specified. （２）安全性に関する事項 Matters related to safety ・挿入ＤＮＡの供与体は、ヒトに対する病原性及び毒素産生性が知られていないものであること。また、大腸菌（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ）のように病原性がある株が知られている場合、病原性がない株に由来することが明らかであること。 • The donor of the inserted DNA should not be known to have any pathogenicity to humans or to produce any toxins. In addition, if any pathogenic strain is known within the donor species, as in the case of Echerichia Coli, it should be clarified that the donor has been derived from a nonpathogenic strain. ・供与体に病原性又は毒素産生性があることが知られている場合、挿入ＤＮＡ自身に毒素産生性がなく、挿入ＤＮＡ由来のタンパク質に病原性がないことが明らかであること。 • If the donor has been reported to be pathogenic or to produce a toxin, it should be clarified that the inserted DNA itself does not produce any toxin, and that the protein(s) derived from the inserted DNA is nonpathogenic. ・挿入遺伝子の供与体に関して、安全な摂取の経験の有無が明らかにされていること。 • It should be clarified whether the donor of the inserted gene has a history of safe consumption. ２　挿入ＤＮＡ又は遺伝子（抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む。）及びその遺伝子産物の性質に関する事項 2 Matters related to properties of the inserted DNA or genes (including antibiotic resistance marker genes) and their gene products （１）挿入遺伝子のクローニング若しくは合成方法に関する事項 (1) Matters related to methods for cloning or synthesizing inserted genes 挿入遺伝子のクローニング若しくは合成方法が明らかであること。 Methods used for cloning or synthesizing inserted genes should be described. （２）塩基数及び塩基配列と制限酵素による切断地図に関する事項 (2) Matters related to number of bases and sequence, and a restriction map with a restriction enzyme 宿主に導入しようとするＤＮＡ断片について、塩基数及び塩基配列が明らかであること。また切断地図が明らかにされ、制限酵素の名称、断片の数・サイズなどが明らかにされていること。 The number of bases and sequence of DNA fragments to be introduced into the host should be specified. The restriction map should also be provided with the names of the restriction enzyme, and the number and sizes of DNA fragments. （３）挿入遺伝子の機能に関する事項 (3) Matters related to the functions of inserted genes 挿入遺伝子の機能及び挿入遺伝子から産生される遺伝子産物（ＲＮＡ及びタンパク質）の性質、機能等が明らかであり、そのタンパク質が有害作用をもたないと判断できる合理的な理由があること。 The functions of inserted genes and the properties and functions of its products (RNA and protein) should be clarified. The rationale for determining that the protein has no adverse effects should be presented. 特に、当該遺伝子産物（タンパク質）がアミノ酸置換等を伴い、食品用酵素としてそのまま使用されるような場合には、必要に応じ、食品製造工程での使用形態や最終食品における推定残存量等を考慮した上で、当該遺伝子産物（タンパク質）の毒性やアレルギー誘発性等の有害作用について安全性上の問題がないと判断できる合理的な理由があること。 In particular, in cases where said gene products (protein) involve amino acid substitutions and will be used as is as a food enzyme, the rational for determining that there are no safety issues associated with toxicity, allergenicity, or other adverse actions of said gene products (protein) should be presented, having given due consideration as needed to usage patterns in the food production process and to the estimated amount remaining in the end food product. ３　挿入遺伝子及び抗生物質耐性マーカー遺伝子の発現に関わる領域に関する事項 3 Matters related to areas involved in the expression of inserted genes and antibiotic resistance marker genes （１）プロモーターに関する事項 (1) Matters related to promoters 用いたプロモーターの由来、性質等が明らかであること。 The origin and properties of promoters used should be described. （２）ターミネーターに関する事項 (2) Matters related to terminators 用いたターミネーターの由来、性質等が明らかであること。 The origin and properties of terminators used should be described. （３）その他、挿入遺伝子の発現制御に関わる塩基配列を組み込んだ場合には、その由来、性質等が明らかであること。 (3) If any other base sequences involved in regulation of expression of the inserted gene are integrated, its origin and properties should be clarified. ４　ベクターへの挿入ＤＮＡの組込方法に関する事項 4 Matters related to methods for incorporating inserted DNA to vectors ベクターへの挿入ＤＮＡの組込方法が明らかであること。具体的には、 The methods for incorporating inserted DNA to vectors should be provided, specifically the following: ・宿主へ導入する発現ベクターの作製方法。特に複数の遺伝子及び遺伝子断片を結合しようとする場合には、その作製方法も記載すること。 • The methods used to construct the expression vector to be introduced into the host. These construction methods should also be described particularly when the vector has been constructed by connecting two or more gene fragments. ・ベクターにプロモーター、オープンリーディングフレーム、ターミネーター、並びに抗生物質耐性マーカー遺伝子を導入した順序及び方法が明らかであること。 • The order and procedures by which the promoter, open reading frame, terminator, and antibiotic resistance marker gene were introduced into the vector should be described. ５　構築された発現ベクターに関する事項 5 Matters related to constructed expression vectors （１）塩基数及び塩基配列と制限酵素による切断地図に関する事項 (1) Matters related to the number of bases and sequence, and a restriction map with a restriction enzyme 構築された発現ベクターについて、挿入ＤＮＡの塩基数及び塩基配列が明らかであること。また切断地図が明らかにされ、制限酵素の名称、断片の数・サイズなどが明らかにされていること。 The number of bases and base sequence of the inserted DNA in the expression vector constructed should be specified. The restriction map should also be provided, with the names of the restriction enzymes, and the number and sizes of DNA fragments. （２）原則として、最終的に構築された発現ベクターには、目的以外のタンパク質を組換え体内で発現するオープンリーディングフレームが含まれていないこと。　仮に、目的以外のタンパク質を発現する可能性のある遺伝子が含まれている場合は、当該遺伝子及びその遺伝子が発現するタンパク質は安全性に問題のないと判断できる合理的な理由があること。 (2) In principle, the expression vector ultimately constructed should not contain any open reading frame that can express an unintended protein within the recombinant. If the vector contains any gene capable of expressing an unintended protein within the recombinant, the rationale for determining the safety of the gene and its product should be presented. （３）宿主に対して用いる導入方法において、意図する挿入領域が発現ベクター上で明らかであること。 (3) The intended insertion area in the expression vector should be clearly indicated in the method used to introduce genes into the host. （４）導入しようとする発現ベクターは、目的外の遺伝子の混入がないよう純化されていること。 (4) The expression vector to be introduced to the host should be purified to prevent contamination with any unintended genes. ６　ＤＮＡの宿主への導入方法に関する事項 6 Matters related to methods for introducing DNA into the host 発現に用いるプラスミドやＤＮＡ構築物等、挿入遺伝子の宿主への導入方法が明らかであること。具体的には、 The method for introducing inserted DNA into the host, including the plasmid or the DNA construct which are used in expression, should be provided. Specifically, ・ＤＮＡの宿主への導入方法（相同組換えなどの技術を利用することにより、必要とされるＤＮＡのみを残し、組換え体から最終的にベクターを排除する場合は、その方法） • the method for introducing the DNA into the host (if only the necessary DNA is left and the vector is ultimately removed from the recombinant through the use of homologous recombination or another technique, that method) and ・選抜方法（ＤＮＡが導入された宿主を選抜する方法）が明らかであること。 • the selection method (the method used for selecting the host to which the DNA is introduced) should be described. ７　抗生物質耐性マーカー遺伝子の安全性に関する事項 7 Matters related to safety of the antibiotic resistance marker gene 抗生物質耐性マーカー遺伝子が使用されている場合は、当該遺伝子及び遺伝子産物の構造及び機能が明らかであること。 When an antibiotic resistance marker gene is used, the structure and function of said gene and its gene product should be clarified. また、添加物の製造工程において遺伝子及びその産物が安全性に問題のない程度まで除去されることが明らかでない場合は、次の事項について組換え体内における変化等の考察も含め、総合的に判断して、抗生物質耐性マーカー遺伝子の安全性が確認されること。 If it is unclear that the marker gene and its product are, during the process of additive production, removed to a degree that they will pose no safety issues, the safety of the antibiotic resistance marker gene should be verified through comprehensive evaluation covering the following matters, including transformation in the recombinant: （１）遺伝子及び遺伝子産物の特性に関する事項 (1) Matters related to attributes of the gene and its gene product ・構造及び機能 • Structure and function 挿入した抗生物質耐性マーカー遺伝子については塩基配列が明らかであり、これ以外の有害塩基配列を含まないこと。 The base sequence of the inserted antibiotic resistance marker gene should be identified and the gene should not contain any other harmful base sequences. 遺伝子産物（タンパク質）については機能が明らかであること。また、必要に応じ、基質特異性が明らかであること。 The function of the gene product (protein) should be explained. If needed, substrate specificity should be identified. 遺伝子産物について、既知のアレルゲン等と一次構造を比較し、構造相同性を有しないこと。 The primary structure of the gene product should be compared to that of known allergens and no structural homology should exist between them. ・耐性発現の機序、使用方法及び関連代謝産物 • Mechanism of resistance expression, method of use, and associated metabolites 抗生物質の使用方法（経口、静注等）が明らかであること。耐性発現の機序が明らかであること。耐性発現に関連する代謝物質が安全性に問題のないものであると判断できる合理的な理由があること。 The administration routes (oral, intravenous, etc.) of the antibiotic should be specified. The mechanism of antibiotic resistance should be explained. The rationale for determining the safety of metabolites associated with resistance expression should be provided. ・同定及び定量方法 • Identification and quantitative methods 抗生物質耐性遺伝子由来の遺伝子産物（タンパク質）の同定及び定量方法があり、発現量が明らかであること。 There should be methods for identifying and quantifying the gene product (protein) derived from the antibiotic resistance gene, and the expression level should be determined. ・遺伝子産物（タンパク質）の各種処理に対する感受性 • Sensitivity of the gene product (protein) to various treatments 人工胃液による酸及び酵素処理、人工腸液によるアルカリ及び酵素処理、加熱等の物理的処理によって、遺伝子産物（タンパク質）の分子量、酵素活性、免疫反応性等が変化するかが明らかにされており、安全性に問題ないものであると判断できる合理的な理由があること。 Data on any alterations in the molecular weight, enzymatic activity, and immunoreactivity of the gene product (protein) by acidic and enzymatic treatment with artificial gastric fluid, alkaline and enzymatic treatment with artificial intestinal fluid, and heat and other physical treatments should be provided. The rationale for determining that these alterations pose no safety issues should be presented. ・アレルギー誘発性 • Allergenicity 遺伝子産物（タンパク質）について、アレルギー誘発性に関する知見が明らかにされていること。 Information on the allergenicity of the gene product (protein) should be provided. （２）遺伝子及び遺伝子産物の摂取に関する事項 (2) Matters related to intake of the gene and its gene products ・耐性の対象となる抗生物質の使用状況（使用方法、使用量、使用目的等）が明らかであること。 • The conditions of use (e.g. methods, amounts, and purpose of use) of the antibiotics to which the gene conferring resistance should be clarified. ・挿入された抗生物質耐性マーカー遺伝子の由来は、通常存在する抗生物質耐性菌と同様のものであること。 • The origin of the inserted antibiotic resistance marker gene should be similar to normally-present antibiotic resistant bacteria. ・抗生物質耐性マーカー遺伝子の遺伝子産物（タンパク質）の摂取量、調理過程及び消化管内における分解量、抗生物質の使用状況等から、検討した抗生物質の不活化に伴う問題がないと判断できる合理的な理由があること。 • The rationale for determining that there is no problem accompanied with the inactivation of the antibiotic should be presented, considering the intake of the gene product (protein) of the antibiotic resistance marker gene, degradation during the cooking process and within the digestive tract, and the conditions of use of the antibiotic. 第５　組換え体に関する事項 No. 5 Matters related to recombinants １　宿主との差異に関する事項 1 Matters related to differences from the host 組換え体と宿主等を比較したデータにより、非病原性及び有害生理活性物質の非生産に関する差異が明らかであり、安全性に問題のないものであること。 Based on comparative data between the recombinant and the host, differences in non-pathogenicity and non-production of harmful, physiologically active substances should be clarified, and there should be no safety issues. ２　遺伝子導入に関する事項 2 Matters related to gene insertion （１）制限酵素による切断地図に関する事項 (1) Matters related to a restriction map with a restriction enzyme 宿主に導入されたＤＮＡ断片について、切断地図が明らかにされていること。なお、この場合、用いた制限酵素の名称、断片の数、サイズ及びサザンブロッティング解析パターンが明らかにされていること。 A restriction map of the DNA fragment introduced into the host should be provided. In such a case, the names of the restriction enzymes, the number and sizes of DNA fragments, and patterns observed in Southern blot analysis should be provided. （２）オープンリーディングフレームの有無並びにその転写及び発現の可能性に関する事項 (2) Matters related to the presence or absence of open reading frames and the possibility of their transcription and expression ・原則として、導入したＤＮＡには、目的以外のタンパク質を発現するオープンリーディングフレームが含まれていないと判断できる合理的な理由があること。なお、その確認に当たっては、目的のタンパク質以外のタンパク質を発現する可能性がないことが、ノーザンブロッティング法、ＲＴ－ＰＣＲ法等を用いて確認できていること。 • In principle, the rationale for determining that the DNA inserted into the host DNA contains no open reading frame that expresses an unintended protein should be presented. The impossibility of DNA insertion leading to expression of an unintended protein should be verified using methods such as northern blotting and RT-PCR. ・仮に、目的以外のタンパク質を発現する可能性のある遺伝子が含まれている場合は、当該遺伝子及びその遺伝子が発現するタンパク質はアレルギー誘発性を含め、安全性に問題のないと判断できる合理的な理由があること。 • If any gene that can express an unintended protein is contained, the rationale for determining that the gene and its product protein do not pose any safety issues, including allergenicity, should be presented. 第６　組換え体以外の製造原料及び製造器材に関する事項 No.6 Raw materials besides the recombinant and production equipment １　添加物の製造原料又は製造器材としての使用実績があること 1 The raw materials and the production equipment used for the additive should have usage records as those of additives. ２　添加物の製造原料又は製造器材としての安全性について知見が得られていること。 2 Information on the safety of the raw materials and the production equipment for the additive should be documented. （１及び２について確認できない場合は、食品又は添加物の製造原料又は製造器材についての安全性が明らかであること。） (If the conditions described 1 and 2 above are not confirmed, the safety of the raw materials and production equipment when used for food or additives should be clarified.) 第７　遺伝子組換え添加物に関する事項 No. 7 Matters related to genetically modified additives １　諸外国における認可、食用等に関する事項 1 Matters related to approval and food usage in foreign countries 諸外国における認可状況に関する情報が明らかにされていること。また、添加物として利用されているか否かに関する情報が明らかにされていること。 Information on the status of approval in foreign countries should be provided. Information on whether or not the said item is being used as an additive should also be provided. ２　組換え体の残存に関する事項 2 Matters related to recombinant residues 組換え体が残存するか否かの確認は、最も適切な工程における試料を用いてドットブロットハイブリダイゼーション法等の適切な試験により実施すること。 The verification of whether residue of a recombinant exists or not should be conducted through appropriate tests such as dot-blot hybridization using samples from the most suitable process. ３　製造に由来する非有効成分の安全性に関する事項 3 Matters related to safety of non-active ingredients derived from production 製造に由来する非有効成分の含有量が、従来の添加物に比べ有意に増加しておらず、かつ、従来の添加物には存在しない非有効成分を含有しないこと。それ以外の場合においては、非有効成分について安全性に問題がないと判断できる合理的な理由があること。 The content of non-active ingredients derived from production should not be significantly increased compared to that of the conventional additive. Also, there should be no non-active ingredients that are not present in the conventional additive. In all other cases, the rationale for determining that non-active ingredients pose no safety issues should be presented. ４　精製方法及びその効果に関する事項 4 Matters related to the method of purification and its effectiveness 添加物の精製方法及びその効果が明らかであり、製造工程において混入する可能性のある有害物質の種類及び量を予測することができ、安全性の上から問題がないと判断できる合理的な理由があること。 The method of purification and its effectiveness should be clarified. The kind and quantity of harmful substances that could potentially become mixed in during the production process should be possible to be estimated, and the rationale for determining that said substances pose no safety concerns should be presented. ５　含有量の変動により有害性が示唆される常成分の変動に関する事項 5 Changes in ordinary components which suggest toxicity due to changes in content 含有量の変動により有害性が示唆される常成分にあっては、その濃度の変動について、従来の添加物と同等であること。仮に変動があっても、安全性の上から問題がないと判断できる合理的な理由があること。 For an ordinary component which suggests toxicity due to changes in its content, changes in their concentration should be the same as those of the conventional additive. Even if there is a change, the rationale for determining that this poses no safety concern should be provided. 第８　第２から第７までの事項により安全性の知見が得られていない場合に必要な事項 No.8 Additional studies required when safety cannot be confirmed based on No. 2 to 7 above 次のうち、必要と考えられる試験成績に基づき、添加物としての安全性が確認できること。 Safety as an additive should be confirmed based on results of those considered necessary among the following: （１）急性毒性に関する試験 (1) Acute toxicity study （２）亜急性毒性に関する試験 (2) Subacute toxicity study （３）慢性毒性に関する試験 (3) Chronic toxicity study （４）生殖に及ぼす影響に関する試験 (4) Reproductive toxicity study （５）変異原性に関する試験 (5) Mutagenicity study （６）がん原性に関する試験 (6) Carcinogenicity study （７）その他必要な試験（腸管毒性試験、免疫毒性試験、神経毒性試験、栄養試験等） (7) Other necessary studies (e.g. intestinal toxicity study, immunotoxicity study, neurotoxicity study, nutrition study)